Avhandling: musslors död i hav och vattendrag undersökta

Det började som en fråga från en länsstyrelse: Varför dör musslorna i våra vattendrag? Anders Alfjorden, expert på blötdjur hos SVA, kunde konstatera att det inte fanns tillräckligt med forskning för att vetenskapligt kunna svara på frågan. Det finns jämförelsevis god kunskap om sjukdomar hos de för vattenbruksnäringen och yrkesfisket ekonomiskt värdefulla arterna blåmusslor och europeiska platta ostron. Men när det gäller sjukdomar hos deras sötvattenslevande artfränder, de långsamväxande sötvattensmusslorna och speciellt flodpärlmusslorna, är kunskapen mycket begränsad. Nu finns flera års forskning om sjukdomar hos dessa sötvattensmusslor, men även marina musslor, samlade i en avhandling.

– En flodpärlmussla kan bli uppåt hundra år gammal, men den växer mycket långsamt och är därför helt ointressant att för vattenbruket. Sedan slutet av 1900-talet är dessa djur också skyddade i sin livsmiljö och får inte plockas upp. En mussla filtrerar i genomsnitt 40 liter vatten per dygn, en koloni med tusen musslor filtrerar cirka 300 kubikmeter på en vecka, säger Anders Alfjorden, forskare på SVA.

Sötvatten

Om ett bestånd i sötvatten plötsligt minskar eller helt dör ut vill myndigheter och de som utnyttjar vattendraget veta vad som pågår. Med ökad kunskap om pågående skeenden skapas en bättre grund att basera nya sjukdomsmodeller på. Med den grunden blir det lättare att fastställa dödsorsaker i framtiden.

– Har det släppts ut föroreningar eller gifter i vattnet? Är det en sjukdom som också kan drabba människor eller finns det andra orsaker? Jag har gått igenom tidigare forskning och utifrån det kombinerat erkänd veterinärmedicinsk metodik med modern teknik för artbestämning. Ett av målen med min avhandling har varit att i ett samlat grepp kombinera gammal kunskap med ny. Det finns fortfarande vita fläckar innan det går att förklara varför en musselkoloni dör ut på en viss plats, men den här forskningen är ett steg på vägen, säger Anders Alfjorden.

Havsmiljö

I havsmiljön är det inte ovanligt att till exempel blåmusslor försvinner lokalt i vissa områden. Ofta sker en populationsförändring över tid som bland annat regleras av naturlig predation från krabbor, sjöstjärnor, dykänder, havskatt med flera.

– Dessa rovdjur påverkar och reglerar naturligt musselpopulationerna i havet. Även parasiter kan påverka och bidra till att minska olika musselbestånd. Det finns bland annat ekologiska undersökningar av hjärtmusslor som visar att parasiter kan spela en viktig roll i att reglera värddjurens förekomst och utbredning, ungefär som i exemplen ovan med akvatiska rovdjur och fåglar. Men i ett artfattigt eller snedvridet ekosystem kan denna balans störas och parasiterna få för stort spelrum, säger Anders Alfjorden.

Vävnadsprover med muskelskador

I vävnadsprover från infekterade musslor observerades muskelskador vid mikroskopisk undersökning. Organförändringarna kunde kopplas till parasiten Hexamita nelsoni.

– Det är första gången som denna parasit har beskrivits kunna infektera blåmusslor. Tidigare undersökningar har endast kunnat visa att den infekterar olika arter av ostron, säger Anders Alfjorden.

Studierna visade också att denna parasit invaderade andra organ, såsom manteln och gonader. Vid närmare studier observerades att parasiten var associerad till äggceller, vilket tyder på att infektionen har en potential att kunna överföras vertikalt, dvs från moderdjur till sin avkomma och inte bara horisontellt genom direkt kontakt. I de allra flesta kända fall idag, sprids akvatiska parasitinfektioner horisontellt genom vattenburen smittöverföring och inte vertikalt.

Inbjudan till disputation

Välkomna till disputationen som äger rum den 1 november kl 9:15 i Lindahlsalen på Uppsala universitet, Evolutionsbiologiskt centrum, Norbyvägen 14 Uppsala. Inbjuden examinator och opponent är professor Ryan Carnegie, Virginia Institute of Marine Science, USA. Handledare är Fabien Burki, Staffan Svärd, B. David Persson och Arni Kristmundsson.

Populärvetenskaplig sammanfattning

Morphological and molecular studies of bivalves to assess the hidden diversity of protistan parasites - Investigations of cryptic diseases in shellfish.

Avhandlingen undersöker sambandet mellan parasitära organismer och dess tvåskaliga värddjur. Dessa blötdjur (marina musslor och ostron i saltvatten, samt sötvattenslevande stormusslor) är stillasittande, filtrerande djur som är beroende av mikrober för sin överlevnad. De konsumerar ett brett spektrum av organismer, varav många är så kallade protister (mikroskopiska eukaryoter). Dessa organismer uppvisar en mycket stor artrikedom och enorm genetisk variation, mer omfattande än de djur, växter och svampar som vi ser omkring oss.

I akvatiska ekosystem har encelliga protister en avgörande betydelse som primärproducenter, rovdjur, nedbrytare eller symbionter och bildar ofta en basal näringsväv av stor betydelse för de flercelliga djurens överlevnad. Parasitära protister kan, trots att de förlitar sig på sina värddjur och utan att själva direkt bidra med tillförsel av näring till ekosystemet, spela en viktig roll genom att reglera olika värddjurspopulationer på ett liknande sätt som rovdjur reglerar bytesdjur i ett gräslandskap.

Sjukdomsbeskrivning av massmortalitet bland svenska flodpärlmusslor (FPM)

Mina undersökningar av parasiter i musslor började på Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA) före starten av denna doktorandtjänst. Där initierades de första undersökningarna avseende kryptiska mass-mortaliteter bland stormusslor, med särskilt fokus på flodpärlmusslan, Margaritifera margaritifera. Detta är en nyckelart av särskild betydelse för akvatiska biotoper och som dessutom är skyddad enligt svensk lag. Arbetet inleddes och initierades genom ett samarbete med flera regionala myndigheter (länsstyrelser) samt Sportfiskarna. Att flodpärlmusslor historiskt under flera tidsperioder varit utsatta för massutrotning är välkänt. Pärlfiske, timmerflottning, vattenreglering och vattenkraftsutbyggnad samt försurning under mitten och slutet av 1900-talet är några orsaker där vi människor bidraget till att bestånden försvunnit eller minskat kraftigt. Istället stod det snart klart att vi stod inför ett nytt fenomen, som inte tycktes kopplat till någon av dessa tidigare kända problem. Genom ett tätt samarbete med en doktorand på Göteborgs universitet, Niklas Wengström gjordes en sammanställning och en översiktsbild av omfattningen och den geografiska spridningen av populationsförlusterna. I denna första publikation sammanfattades också preliminära fynd från påbörjade veterinärmedicinska undersökningar och genomförda analyser. Därigenom kunde vi, tillsammans och med stöd från den nationella samordnaren för FPM-övervakningen, redovisa en sammanfattande sjukdomsbeskrivning som också innefattade jämförande patolog-anatomiska beskrivningar av friska och påverkade populationer. Trots en tydlig sjukdomsbild kunde dock inga slutsatser dras om eventuella orsaker till observerade förändringarna.

Fylogeni, morfologi och patologisk beskrivning av gregariner i FPM från en sjukdomspåverkad population

I en uppföljande studie undersöktes den senast rapporterade dödligheten i Västra Götalandsregionen. Två populationer med sötvattenspärlmusslor (FPM) studerades under en treårsperiod vid olika årstider: sensommar, höst och försommar. En av dessa musselpopulationer, hade drabbats av betydande förluster (65% mortalitet sedan senaste beståndsuppskattningen 2016). I musslorna från denna population, upptäcktes en tidigare ej beskriven parasitär infektion. Dessa encelliga parasiter tillhörde gruppen gregariner (Apicomplexa), encelliga organismer som främst är kända för att infektera insekter och andra ryggradslösa djur. Dessa fynd utgör de första rapporterna av dessa parasiter i sötvattensmusslor (Unionida), från Sverige och vad vi känner till idag, övriga världen. Med märkning genom specifika ribosomala prober av histologiska musselprover identifierades en parasitär cellinfiltration (in situ-hybridisering, ISH) kopplad till påvisade gregariner. Genom ultrastrukturanalys (elektronmikroskopi) påvisades också gregariner i musslornas inre organ. Baserat på observationer med histopatologi, cytologi, ISH och TEM presenterade vi också en tänkbar livscykel, som modell för hur denna parasit skulle kunna invadera, spridas inuti musslan och därefter återgå till den akvatiska miljön.

Gregarin infektion i gonader hos en population med reproduktionsstörning

I syfte att ytterligare följa upp dessa första fynd av gregariner, genomfördes en kompletterande undersökning avseende gensekvenser i prover från den andra musselpopulationen (utsedd som referensgrupp) där också gregariner påvisats genom PCR, men som ej kunnat identifieras morfologiskt eller kopplas till sjukdomstecken. Med hjälp av nya prover, och prov från den föregående undersökningen, genomfördes kompletterande mikroskopiska analyser av det histologiska materialet. Denna gång med hjälp en annan mikroskopisk spårningsmetod, utvecklad för analys av bakterier eller plankton i miljöprover. Med denna metod, Catalyserad Reporter Deposition - Fluorescens - In Situ-Hybridisering (CARD-FISH) kunde vi specifikt spåra dessa tidigare icke spårbara gregariner till olika organ och patologiska förändringar som inte upptäcktes vid den föregående undersökningen. Detta öppnar för unika möjligheter att framöver leta efter tidigare okända/obeskrivna arter där det endast finns genetisk signal men där vi idag saknar kunskaper om utseende, funktion och spridning i värddjuret. Det främsta resultatet från denna undersökning var identifiering av maskliknande gregariner, ihopkrullade inuti eller i anslutning till flodpärlmusslornas äggceller inuti gonadfolliklarna. Morfologiskt liknande de gregariner som främst påvisats i marina musslor från havsmiljön, dvs. släktet Nematopsis spp.(Porosporidae). Denna studie är ej avslutad och fler resultat är att vänta.

Första påvisade fallet med Hexamita nelsoni i blåmusslor

I marina miljöer är kunskapen om encelliga parasiter oftast mycket bättre, och många parasit-arter finns dokumenterade och beskrivna för olika arter av tvåskaliga djur såsom ostron, blåmusslor, kammusslor, hjärtmusslor, knivmusslor och venusmusslor. Trots detta kvarstår olika patologanatomiska organförändringar som ej har fått någon förklaring. Ett sådant exempel är de skador i muskulatur, identifierade vid rutinövervakning av svenska ostron och blåmusslor. Skadorna kännetecknades av svällda muskelfibrer, i allvarliga fall också av nekrotiska skador och muskelsönderfall. Genom försök med cellodlingsteknik, har vi under µ-aero fila förhållanden, lyckats isolera flagellater, tillhörande gruppen diplomonada från muskelbiopsier. Isolat som senare identifierades som Hexamita nelsoni genom PCR av isolat från provtagna blåmusslor. Med hjälp av CARD-FISH, beskriven ovan, observerades flagellaterna cytologiskt i cellkultur. Detta följdes upp genom studier av fixerade och snittade vävnadsprov från infekterade musslor. Därigenom kunde vi koppla organförändringar till våra isolat av Hexamita nelsoni, inte bara i muskelvävnaden, utan också till förändringar i andra organ, såsom manteln och gonader. Observationer av H. nelsoni inuti äggceller, antyder att Hexamita nelsoni också skulle kunna överföras vertikalt och inte bara horisontellt genom vattenburen kontakt.

Densitetsgradient filtrering som metod för cellanrikning och genomiska studier

När det gäller parasitära sjukdomar i marina miljöer (saltvatten) har vi mycket större kunskap, bland annat då flera av de marina mussel- och ostronarterna är föremål för vattenbruk och därmed av stort ekonomiskt värde. Hot såsom sjukdomar har ur ett djurhälsoperspektiv stor betydelse for mussel- eller ostronodlingarnas ekonomi. I denna sista artikel undersöker vi ett av de mest betydande parasitiska hoten mot just europeisk mussel- och ostronodling, nämligen parasiter tillhörande gruppen Ascetosporea. I denna grupp ingår flera anmälningspliktiga sjukdomar såsom, Bonamia spp och Marteilia spp. samt Microcytos mackini. Dessa parasiter är inte möjliga att undersöka genom cellodling. Att studera genuttryck (genomik) avseende cellfunktion och evolutionära mönster med mera, kräver därför andra metoder, där man först måsta rena fram celler i tillräckligt hög koncentration för att därefter kunna göra djuplodande genanalyser. Med hjälp av olika typer av mekanisk finfördelning och filtrering, samt därefter följande densitetsfiltrering, gick det att extrahera fram ett cellkoncentrat av de intracellulära parasiterna från infekterade vävnadsprover. För detta använde jag två olika metoder för cellkoncentration, dels av blåmusselprover infekterade med Marteilia pararefringens och dels prov från platta ostron infekterade med Bonamia ostreae. Detta möjliggjorde efterföljande analys där släktskap och unika egenskaper för denna organism grupp kunde beskrivas.